उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा फलों और सब्जियों में ऑक्सालिक अम्ल की मात्रा का निर्धारण
1. प्रायोगिक सिद्धांत और विधि डिजाइन
फलों और सब्जियों में पाए जाने वाले एक सामान्य कार्बनिक अम्ल के रूप में, ऑक्सालिक अम्ल की मात्रा भोजन के स्वाद और पोषण मूल्य को सीधे प्रभावित करती है। इस प्रयोग में रिवर्स-फेज़ हाई-परफॉर्मेंस लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (RP-HPLC) का उपयोग किया गया है। अम्लीय मोबाइल फेज़ की स्थिति में, C18 क्रोमैटोग्राफिक कॉलम का उपयोग करके ऑक्सालिक अम्ल को अन्य पदार्थों से अलग किया जाता है। ऑक्सालिक अम्ल अणुओं में कार्बोक्सिल समूहों के पराबैंगनी अवशोषण गुणों के आधार पर मात्रात्मक विश्लेषण के लिए 210 एनएम पर सेट पराबैंगनी डिटेक्टर का उपयोग किया जाता है।
2. मानक वक्र और नमूना तैयार करना
मानक विलयन तैयार करने के लिए ग्रेडिएंट डाइल्यूशन विधि का उपयोग किया जाता है: ऑक्सालिक एसिड डाइहाइड्रेट के 25.0 मिलीग्राम को सटीक रूप से तौलें और 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर का स्टॉक विलयन प्राप्त करने के लिए इसे 25 मिलीलीटर अतिशुद्ध जल से पतला करें। इसे क्रमिक रूप से 50, 100, 200, 400 और 800 माइक्रोग्राम/मिलीलीटर की मानक विलयनों की श्रृंखला में पतला किया जाता है, जिसमें प्रत्येक सांद्रता को तीन बार इंजेक्ट किया जाता है।
नमूना तैयार करने के लिए, माइक्रोवेव-सहायता प्राप्त निष्कर्षण विधि का उपयोग किया जाता है: 5.00 ग्राम फल/सब्जी के समरूप मिश्रण का वजन करें, उसमें 10 मिलीलीटर 0.1 मोल/लीटर हाइड्रोक्लोरिक अम्ल का घोल मिलाएं, 60°C पर माइक्रोवेव से 10 मिनट तक उपचारित करें, 0.45 माइक्रोमीटर झिल्ली फिल्टर से छान लें और परीक्षण के लिए निस्पंदित द्रव एकत्र कर लें।
3. क्रोमैटोग्राफिक स्थितियों का अनुकूलन
मोबाइल फेज 0.01 मोल/लीटर पोटेशियम डाइहाइड्रोजन फॉस्फेट बफर (pH 2.5)–एसीटोनाइट्राइल (95:5) सिस्टम है, जिसमें प्रवाह दर 0.8 मिलीलीटर/मिनट और कॉलम तापमान 35°C है। एसीटोनाइट्राइल के अनुपात को समायोजित करने पर पता चलता है कि जब कार्बनिक फेज 10% से अधिक हो जाता है, तो ऑक्सालिक एसिड का प्रतिधारण समय 3 मिनट से कम हो जाता है, लेकिन पीक टेलिंग होने लगती है। अंतिम अनुकूलित परिस्थितियों में, ऑक्सालिक एसिड का प्रतिधारण समय 4.2 मिनट है, जिससे आसन्न साइट्रिक एसिड और मैलिक एसिड से पूर्ण पृथक्करण प्राप्त होता है (रिज़ॉल्यूशन > 1.5)।
4. विधि सत्यापन
रेखीय सीमा सत्यापन से पता चलता है कि 10–1000 µg/mL की सीमा में शिखर क्षेत्र और सांद्रता के बीच एक अच्छा रेखीय संबंध है (R² = 0.9993)। सिग्नल-टू-शोर अनुपात विधि द्वारा निर्धारित पता लगाने की सीमा (LOD) 0.5 µg/mL है। दोहराव परीक्षणों में, पालक के एक ही नमूने के छह दोहराव वाले निर्धारणों के लिए RSD 1.8% है। तीन स्तरों (80%, 100%, और 120%) पर स्पाइक रिकवरी प्रयोगों से क्रमशः 98.2%, 102.4%, और 97.8% की औसत रिकवरी प्राप्त होती है, जो मात्रात्मक विश्लेषण की आवश्यकताओं को पूरा करती है।
5. वास्तविक नमूनों का विश्लेषण
बाजार में आसानी से उपलब्ध छह फलों और सब्जियों का परीक्षण किया गया: पालक (356 ± 12 मिलीग्राम/100 ग्राम), अजवाइन (215 ± 9 मिलीग्राम/100 ग्राम), टमाटर (18 ± 2 मिलीग्राम/100 ग्राम), सेब (6 ± 1 मिलीग्राम/100 ग्राम), केला (पता नहीं चला) और ब्रोकोली (89 ± 5 मिलीग्राम/100 ग्राम)। राष्ट्रीय मानक विधि (GB 5009.277-2016) से तुलना करने पर पता चलता है कि दोनों विधियों के बीच सापेक्ष विचलन 5% से कम है, जो इस विधि की विश्वसनीयता को प्रमाणित करता है। विशेष रूप से, कम मात्रा वाले नमूनों का विश्लेषण करते समय HPLC विधि पारंपरिक अनुमापन विधियों की तुलना में अधिक संवेदनशीलता प्रदर्शित करती है।
6. मुख्य बिंदु
नमूने के पूर्व-उपचार के दौरान pH मान को सख्ती से नियंत्रित करें। यदि अर्क का pH 3 से अधिक हो जाता है, तो कैल्शियम ऑक्सालेट अवक्षेपण के कारण परीक्षण परिणाम कम हो सकते हैं। लवण अवक्षेपण और कॉलम अवरोधन से बचने के लिए मोबाइल चरण को प्रतिदिन ताजा तैयार किया जाना चाहिए। प्रत्येक 20 इंजेक्शन के बाद, कॉलम की कार्यक्षमता में गिरावट को रोकने के लिए कॉलम को एसीटोनिट्राइल-जल (30:70) से 30 मिनट तक धोएं। रंगद्रव्य युक्त नमूनों (जैसे, बैंगनी गोभी) के लिए, इंजेक्शन से पहले ठोस-चरण निष्कर्षण शुद्धिकरण चरण जोड़ने की सलाह दी जाती है।
7. अनुप्रयोग एवं विस्तार संबंधी निर्देश
इस विधि का उपयोग मूत्र और रक्त जैसे जैविक नमूनों में ऑक्सालिक अम्ल का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। मोबाइल फेज की संरचना को समायोजित करके (उदाहरण के लिए, टेट्राब्यूटाइलअमोनियम हाइड्रॉक्साइड मिलाकर), ऑक्सालिक अम्ल और इसके मेटाबोलाइट्स का एक साथ निर्धारण किया जा सकता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री डिटेक्टर के साथ संयोजन से, अधिक सटीक ट्रेस डिटेक्शन विधि विकसित की जा सकती है। खाद्य प्रसंस्करण उद्योग में, यह विधि कम ऑक्सालिक अम्ल वाली किस्मों के चयन और खाना पकाने की प्रक्रियाओं के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण डेटा सहायता प्रदान कर सकती है।
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